張鋒揭露SHERLOCK新冠病毒檢測系統(tǒng)背后的細(xì)節(jié)：解決這兩個問題最為關(guān)鍵

直到本周二，在一場線上分享會中，SHERLOCK 系統(tǒng)的主要開發(fā)者、CRISPR 應(yīng)用領(lǐng)域的先驅(qū)之一張鋒再次露面，用近 40 分鐘的時間分享了這一新冠檢測神器背后的開發(fā)歷程和技術(shù)解決路徑。
SHERLOCK 系統(tǒng)基于基因編輯工具 CRISPR-Cas13，最初曾在多種人類樣本（如唾液）中發(fā)現(xiàn)寨卡、登革熱等病毒的 RNA 序列，甚至一些與癌癥突變相關(guān)的序列，其對 RNA 和 DNA 的檢測靈敏度都達(dá)到了單分子級。
這種檢測方法與驗孕棒類似，只需一張試紙就能顯示出病毒感染檢測結(jié)果，在新冠病毒的檢測中，該技術(shù)只需 1 小時就能判斷是否存在新冠病毒。
“我們的產(chǎn)品通過兩步改造最終解決了兩個關(guān)鍵問題”，張峰在分享過程中說。

生輝全程記錄了張鋒的分享過程，以下為基于原意修改的分享實錄：
我之前一直在麻省理工學(xué)院的實驗室開發(fā)用于分子診斷的 CRISPR 輔助系統(tǒng)。幾年前，我們開發(fā)了 SHERLOCK，用于檢測 SARS 病毒和寨卡病毒等。今年年初，我在《紐約時報》讀到了對一種新型病毒的報道，也就是現(xiàn)在的新型冠狀病毒，當(dāng)時在病毒出現(xiàn)的地方爆發(fā)了眾多連鎖反應(yīng)。我想，也許可以利用 SHERLOCK 去檢測這種新型病毒。于是，我們的實驗室開始重新設(shè)計不同引物和 Guide-RNA (引導(dǎo) RNA），希望能夠查明新冠病毒的部分序列。
但在幾個星期后，COVID-19 的病毒序列正式對外公布。1 月下旬，我開始收到很多來自中國同事的郵件，其中一位在武漢的同事在 2 月初給我發(fā)來這張他站在武漢火車站附近的照片，他說過去這里人聲鼎沸，但因為新冠病毒的傳播我們不得不封鎖整個城市，你能不能與我們合作開發(fā)一種方法，在病毒傳播的初期實現(xiàn)快速診斷。

于是我們啟動了這一項目。
SHERLOCK 的工作原理如下，它需要兩步反應(yīng)，首先是擴增，但 SHERLOCK 的擴增過程非常簡單，不需要 PCR 的過程，而是采用等溫擴增的方法。這就意味著病毒經(jīng)過等溫擴增后，在 CRISPR 蛋白中加入一個 Guide-RNA 就可以準(zhǔn)確識別病毒序列。在識別病毒序列的過程中，Cas 蛋白就不僅可以切割病毒序列，還可以切割探針進(jìn)而讀出結(jié)果。
我們用的探針是一段兩端攜帶分子的較短的等位基因，這讓其可以在試紙上顯示結(jié)果。如果病毒存在就會看到兩條線，如果病毒不存在就只能看到一條線，這和驗孕試紙的運作方式十分類似。隨后，我們用開發(fā)的引物和 Guide-RNA 制作了簡易的檢測試劑盒，供全球的科學(xué)家和醫(yī)院使用，并開始收集試驗結(jié)果。

我們收到的第一組數(shù)據(jù)是來自于華盛頓大學(xué)的 Keith Jerome 和 Greninger 小組。

在 3 月，西雅圖是新冠病毒傳播最肆虐的區(qū)域之一，所以華盛頓大學(xué)的研究小組訪問了不同的病人樣本并用 SHERLOCK 系統(tǒng)展開檢測測試。他們發(fā)現(xiàn)通過鼻咽拭子提取唾液樣本后，SHERLOCK 能夠準(zhǔn)確檢測出病毒。檢測試紙（下圖）顯示，上方出現(xiàn)的橫線代表病毒存在，下方的橫線是陽性對照，我們能夠看到在所有的陽性樣品上方都出現(xiàn)了檢測線。

除了和 Keith 的小組合作，另一個合作者也和上述團(tuán)隊一同對 SHERLOCK 進(jìn)行測試。他們從取樣測試中發(fā)現(xiàn)靈敏度相當(dāng)不錯，能夠達(dá)到 93％，同時具有 100％的特異性，不會顯示假陽性信號?；谶@些數(shù)據(jù)，他們開始申請許可并在泰國當(dāng)?shù)氐尼t(yī)院大范圍使用 SHERLOCK，我們也得到了有效的反饋（如下圖）。

根據(jù)不同的合作者的反饋，我們了解到 SHERLOCK 可以有效地檢測新冠病毒，但它仍有一個不容忽視的缺點。SHERLOCK 檢測是兩步反應(yīng)，其中包含運行擴增、打開擴增管再將試劑移到第二個反應(yīng)管中，之中隱藏著試劑污染的風(fēng)險，這甚至?xí)T導(dǎo)產(chǎn)生假陽性。
所以我們嘗試解決這一問題，并開發(fā)了一個新的反應(yīng)體系，我們稱之為 STOPCovid 1，這是 SHERLOCK 檢測的一個部分。我們將擴增過程和 CRISPR 檢測過程整合至單一反應(yīng)中。它的工作原理是這樣的：通過鼻咽拭子收集唾液樣本，然后提取其中的 RNA，讓其進(jìn)入拷貝反應(yīng)并在 60°C 的環(huán)境中培養(yǎng)一個小時，最后將檢試紙直接放入反應(yīng)管讀取病毒檢測結(jié)果。

但實現(xiàn)上述過程之前必須要解決一些問題。
第一，簡化病毒 RNA 的提取。早在 3 月或 4 月，RNA 提取試劑盒和提取柱非常短缺，因此我們開發(fā)了提取緩沖液，稱為快速提取（QuickExtract），通常用于分析病毒的 RNA 基因組。事實證明，QuickExtract 能夠快速分解鼻咽拭子的唾液并釋放病毒 RNA，無需基于提取柱純化等過程，同時我們發(fā)現(xiàn)，QuickExtract 和通過提取柱檢測的靈敏度水平表現(xiàn)相似（下圖）。

第二個問題，反應(yīng)溫度。STOPCovid 1 的反應(yīng)溫度是 60°C，而我們之前選用的 CRISPR 蛋白大部分都不穩(wěn)定，它們的工作溫度是在 37°C。在 60°C 的條件下，蛋白會失去活性。所以我們從嗜熱細(xì)菌中尋找合適的蛋白，并發(fā)現(xiàn)了兩種合適的樣品：來自 Aac 細(xì)菌和 Aap 細(xì)菌的蛋白都能夠在 60° 下穩(wěn)定存活，這樣我們就可以實現(xiàn)擴增和檢測的過程。從圖中可以看見 Aap 細(xì)菌的蛋白（藍(lán)線）的效果更好，穩(wěn)定性也更強，我們用其檢測 200 份左右的樣品得到了下面的數(shù)據(jù)圖。

但我們?nèi)韵Ｍ寵z測更加快速地進(jìn)行，也能識別更多信號。為了達(dá)到這一目標(biāo)，我們測試了不同的反應(yīng)添加物，以增強反應(yīng)過程。因此，我們訂購了多種不同的化合物以提高反應(yīng)效率。通過系統(tǒng)的分析，發(fā)現(xiàn)甘氨酸（Glycine）和?；撬幔═aurine）是效果最好的添加劑，可以同時增加反應(yīng)速度、信號強度和反應(yīng)容量。大家可能都聽說過牛磺酸，可以增強人體機能，讓我們能熬夜看論文（笑）。


以上是我們所做部分工作，我們將上述每一步改造過程結(jié)合起來開發(fā)了 STOPCovid 1 系統(tǒng)。我們也將他與 LAMP 檢測方式（環(huán)介導(dǎo)等溫擴增）進(jìn)行了比較。從左圖中可以看到，隨著時間的推移，LAMP 會出現(xiàn)誤報信號。圖中右側(cè)的三條線顯示，它們的實際信號輸出低于檢測閾值。而右圖中數(shù)據(jù)顯示，如果添加了 CRISPR 蛋白和上述添加劑，可以擺脫假陽性信號，實現(xiàn) 100% 的檢測特異性。而這一反應(yīng)甚至可以在簡易水浴環(huán)境下進(jìn)行，低成本投入?yún)s能獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

但與 SHERLOCK 系統(tǒng)相比，STOPCovid 1 系統(tǒng)雖然簡單便易，但檢測靈敏度仍未達(dá)到同等水平，因此，我們又開發(fā)了 STOPCovid 2 系統(tǒng)，利用磁性轉(zhuǎn)珠（BEAD）優(yōu)化 RNA 提取和富集過程以提高特異性和敏感度。
STOPCovid 2 的主要工作方式是將鼻咽拭子樣本添加到反應(yīng)管中，利用磁力控制實現(xiàn)病毒 RNA 的裂解，再利用 BEAD “捕捉” RNA 將其提取出。此時 RNA 的裂解緩沖液仍保留在 BEAD 上，但已經(jīng)濃縮成較小的體積。加入 STOP Covid 反應(yīng)試劑，充分溶解后可以用熒光或者試紙的方式進(jìn)行檢測。

這是（下圖）STOPCovid 1 和 2 之間的對比，根據(jù)兩個不同的患者樣本。不難發(fā)現(xiàn) STOPCovid 1 的檢測靈敏度與 RT-qPCR CT 值 30 相當(dāng)。而 STOP Covid2 可以達(dá)到的 RT-qPCR CT 值為 40。所以基于 Covid-19 患者的輸入統(tǒng)計情況可以發(fā)現(xiàn)，如果 CT 值達(dá)到 40，則證明它可以成功檢測幾乎 100％的病人， 如果 CT 值為 30，則證明只能成功捕獲 60％的患者。所以將 CT 值提高至 40-50 左右非常重要。值得注意的是， CT 值達(dá)到 40 的患者感染力可能有所減弱，因為病毒向環(huán)境擴散的能力顯著降低。

隨后，我們的合作者展開了系統(tǒng)的測試，他們共檢測的 400 余個樣本，其中包含 202 個陽性樣本和 200 個陰性樣本。結(jié)果顯示，STOPCovid 2 能夠得到 93.1% 的靈敏度和 98.5% 的特異性，檢測結(jié)果與 RT-qPCR 檢測的靈敏度和特異性幾乎一致。

這是其中 200 個樣本檢測結(jié)果，可以看到在遠(yuǎn)端才出現(xiàn)了個別假陽性情況。

隨后，我們又將患者打散再次進(jìn)行測試。左側(cè)顯示在陰性測試中，患者均無法檢測出病毒，右側(cè)的陽性患者中，能夠檢測出積極的信號。檢測的 CT 范圍在 20-35.7 之間。


目前，我們已經(jīng)在開發(fā)設(shè)計一種小型的檢測儀器，不需要移液器等設(shè)備就能實現(xiàn)檢測。我們設(shè)計的工作方式是，儀器中將包含一個富集管，操作人可以將蘸有唾液的棉簽直接插入溶解病毒的富集管內(nèi)，提取后將病毒溶解在提取緩沖液中，最后插入設(shè)備運行 30 分鐘就能完成測試。我希望這能幫助人們以一種非常簡單的方式檢測新冠，尤其是護(hù)理機構(gòu)和家庭中能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測。
我的分享就到這里，我們將繼續(xù)努力。我想感謝我的實驗室成員和合作者，以及那些支持這項工作的資助機構(gòu)，謝謝。
在隨后提問環(huán)節(jié)中，張峰也回答了一些觀眾提問，內(nèi)容整理如下：
提問：能檢測到多大的病毒 RNA 片段？
張鋒：STOP Covid 中的 Guide-RNA 是一段 24 個堿基配對的序列，我們用它來識別部分病毒，但只是其中一個引物，我們其實用了六個不同的引物以擴大檢測片段，其中包含 2 輪檢測，這就是為什么 STOP Covid 能夠得到更好的靈敏度。
提問：檢測價格估計會是多少錢？
張鋒：檢測費用取決于測試的規(guī)模。酶、Guide-RNA、引物等都需要生產(chǎn)，每次檢測的價格或許在一美元左右，或者稍多于一美元，如果能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；闹圃欤瑱z測的價格可能會更便宜，
提問：甘氨酸和?；撬岬墓ぷ髟硎鞘裁?？ 
張鋒：我們目前也不太清楚甘氨酸和?；撬岬墓ぷ髟?，它們可能起到維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用，以確保他們在反應(yīng)中更穩(wěn)定。我們測試的添加劑是可商購的，一共有 96 種，包含凍干試劑、優(yōu)化特定反應(yīng)的生化試劑，甚至是結(jié)晶體。
提問：有一個瑞士的研究小組將納米金顆粒生物傳感器用于環(huán)境內(nèi)新冠病毒含量的監(jiān)測中，在實現(xiàn)這一目的之前需要完成哪些必要的步驟？
張鋒：所有這些環(huán)境監(jiān)測項目都可以使用分子檢測方法來完成，無論是 PCR、等溫擴增甚至是基于等溫擴增的 CRISPR 檢測。最初的步驟是收集環(huán)境中的樣品并將其濃縮，目前已經(jīng)有很多設(shè)備可以實現(xiàn)這一過程，例如 RNA 提取柱可以將較大的輸入量濃縮到較小的體積中，如果這些方法能夠增加測試的靈敏度，我們都可以去嘗試。
當(dāng)然，研究人員已經(jīng)使用這種方法來測試廢水，麻省理工學(xué)院的一位教授一直在使用 PCR 檢測法來尋找廢水樣本中新冠病毒。這一研究也在馬薩諸塞州污水處理局網(wǎng)站線上發(fā)布，你可以去看看。而隨著 Covid-19 在美國的傳播可以看到污水內(nèi)病毒含量的增加和降低，這一數(shù)據(jù)可以用于監(jiān)測陽性病例患者的數(shù)量變化，這些都是非常有用的應(yīng)用。
提問：新冠肺炎不是我們最后一次遇到的傳染病，這種檢測方式對我們?nèi)粘Ｓ龅降钠渌《臼欠裼行В?/strong>
張鋒：檢測中的反應(yīng)是一個通用的分子擴增反應(yīng)過程，所以假設(shè)病毒的 DNA 或 RNA 可以從病毒顆粒中釋放出來，那么就應(yīng)該可以讀取它。但有一個挑戰(zhàn)是，你從病人身上收集的病毒或樣本可能含有抑制劑，會阻止擴增或阻止脆性病毒的檢測。因此，有不同的方法去降解抑制物。第一種，添加裂解蛋白的蛋白酶后在進(jìn)行復(fù)制檢測。第二種，檢測過程中可能存在小分子化合物，因此你可能需要用到過濾器等設(shè)備，降低抑制劑的含量。
提問：檢測出的陽性信號對確定病毒含量來說是否有價值？它是否處于線性動態(tài)范圍內(nèi)？
張鋒：有這個可能性。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將 LAMP 和 CRISPR 反應(yīng)結(jié)合會得到一種類似二進(jìn)制的信號 —— 陰性或陽性。但當(dāng)病毒載量變大，高病毒負(fù)載的信號出現(xiàn)的時間會比較慢，低病毒負(fù)載的信號出現(xiàn)時間會比較長。我認(rèn)為有可能生成一條以不同輸入濃度為變量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。我們在弄清楚檢測信號的上升時間，也許可以用它來推斷病毒載量。
目前我們還沒有足夠的病人樣本數(shù)據(jù)，還無法證實這一情況，其中最重要的變量是在患者樣本中可能含有的抑制劑數(shù)量，所以我認(rèn)為對于純化的 RNA 樣本可以建立一個標(biāo)準(zhǔn)曲線，但對于病人樣本，我們還需要做更多工作。
提問：可以一次性檢測多種病毒嗎？
張鋒：這是有可能的?？梢允褂枚鄠€ CRISPR 蛋白，多路裂解 RNA 或 DNA。例如可以一個用于流感，一個用于 Covid-19，一個用于呼吸道融合病毒 RSV 等，每一種病毒會發(fā)出不同的顏色作為信號，利用這一點來實現(xiàn)多路復(fù)用，檢測多種病毒。
提問：與 CRISPR Cas12a 檢測相比，主要功能差異是什么？
張鋒：在反應(yīng)中我們使用 Cas12b 作為 CRISPR 蛋白，原因是部分 Cas12b 來自嗜熱細(xì)菌，這讓其能夠在 60℃下工作。Cas12a 在 37℃下可以工作，但是在 60℃下就不行了。這也是之所以我們用 Cas12b 的原因。